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首頁技術文章組織研磨儀在豬瘟病毒實時熒光RT-PCR檢測樣品方法中的應用

組織研磨儀在豬瘟病毒實時熒光RT-PCR檢測樣品方法中的應用

更新時間:2018-11-30      瀏覽:2271次

豬瘟檢測,主要監(jiān)測手段是實時熒光定量PCR,大致流程步驟為:樣品研磨(制備樣品)----磁珠提取(提取DNA,RNA)----結合試劑盒上實時熒光定量PCR儀檢測。而在樣品研磨過程中采用新銳精儀組織研磨儀GD200、GD300GD16都可以很好運用到這一環(huán)節(jié)中來,下面以GD16為例:

 

1 器材和設備

1.1組織研磨儀GD16

1.2離心管

1.3 高速臺式冷凍離心機:大離心力12000g以上

1.4冰箱

1.5 熒光PCR檢測儀

1.6 微量移液器和吸頭

 

2 樣品的采集

2.1采樣注意事項

采樣及樣品前處理過程中應戴一次性手套,樣本不得交叉污染。

2.2采樣工具

扁桃體采樣器:鼻捻子、開口器和采樣搶。使用前均應用3%氫氧化鈉溶液浸泡5Min~10Min,經清水沖洗。

滅菌牙簽和0.5ml1.5ml離心管經(121±2)℃,高壓滅菌15Min;剪、鑷經160℃干烤2h。

2.3 采樣方法

2.3.1 活體樣品

固定活豬的上唇,用開口器打開口腔,用采樣搶采取扁桃體樣品,用滅菌牙簽挑至0.5ml1.5ml離心管并作標記,編號送實驗室。取待檢樣品,按1:5倍體積加入DEPC水,于研缽或組織勻漿器中充分研磨,3000g離心15min,取上清液轉入離心管中編號備用。

2.3.2 內臟樣品

采取病死豬各種臟器(淋巴結、胰臟、脾臟、回腸、肝臟和腎臟)裝入一次性塑料袋或其他滅菌容器,編號,送實驗室。取50mg~100mg待檢樣品,按1:5倍體積加入DEPC水,于研缽或組織勻漿器中充分研磨,3000g離心15min,取上清液轉入離心管中編號備用。

2.3.3  4%EDTA抗凝血

用無菌注射器直接全血,注入含1/10 4%EDTA溶液的無菌容器中,充分混勻后編號備用。

2.3.4 排泄物

挑取少許糞便樣本于離心管中,加入適量生理鹽水,振蕩混勻,室溫3000g,離心管15min,取上清液轉入離心管中編號備用。其余液體排泄物直接轉入離心管編號備用。

2.3.5 細胞培養(yǎng)物

細胞培養(yǎng)物凍融3次,轉入離心管中編號備用。

2.3.6 存放與運送

采集或處理的樣品在2~8℃條件下保存應不超過24h;若需長期保存,應放置-70℃冰箱,但應避免反復凍融(凍融不超過3次)。采集的樣品密封后,采用保溫壺或保溫桶加冰密封,在6h~8h之內運送到實驗室。按照《獸醫(yī)實驗室生物安全技術管理規(guī)范》進行樣品的生物安全標識。

 

3.實時熒光RT-PCR檢測

 

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